人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。

目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。

方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后，制成单细胞悬液，加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养，传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。

结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示，诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1，Col-Ⅰ，牙本质涎蛋白表达阳性外，还有巢蛋白，神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性，而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞，在一定的诱导培养条件下，牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 干细胞培养与分化, 人牙髓细胞, 培养, 免疫表型, 多向分化

Abstract:

BACKGROUND: The discovery and concept of pulp tissue-derived stem cells is beneficial to the understanding of tooth development and regeneration and repair mechanisms from the cellular level.

OBJECTIVE: To understand the induced differentiation capacity and induced conditions in vitro of human dental pulp stem cells into neuron-like cells.

METHODS: Pulp tissue was separated from human healthy third molars. Single cell suspensions were prepared and seeded into 6-well plates containing alpha-modified minimum essential medium supplemented with 15% fetal bovine serum. Subconfluent cultures (first passage) of colony forming cells were induced with butylhydroxy anisole, forskolin, β-mercaptoethanol, basic fibroblast growth factor.

RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescence and reverse transcription-PCR assay showed that human dental pulp stem cells positively expressed stro-1, Col-I, dentin sialoprotein after 2 weeks of induction. Nestin and neuron-specific enolase were strongly expressed, but the gingival fibroblasts were negatively expressed. It indicates that adult stem cells in human dental pulp have a high neuron-like cell differentiation potential under a certain inductive condition.

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Key words: stem cells, dental pulp, cell differentiation, immunophenotyping

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

材料：

主要试剂：α-MEM培养基、Collagenase typeⅠ、胎牛血清、Dispase、碱性成纤维细胞生长因子、TRIzol、Access RT- PCR System Kit、Superscript Ⅱ反转录酶、Taq DNA聚合酶(Gibco公司，美国)；β-巯基乙醇、forskolin、丁羟基茴香醚、氢化可的松(Sigma公司，美国)；抗胶质纤维酸性蛋白单抗、抗神经元特异性烯醇化酶单抗、抗牙本质涎蛋白多克隆抗体、抗牙本质基质蛋白多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)；二甲基亚砜(西安化学试剂厂)；内参对照GAPDH引物(广州英伟创津有限公司)。

主要仪器：CO₂培养箱(Heraeus公司，德国)，YJ- 875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympus公司，日本)，PCR仪、台式低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)，免疫荧光试剂盒(武汉博士德)。

方法：

人牙髓干细胞的培养：按 Gronthos等^[4]的方法，取健康青年第三磨牙(16-30岁)，拔除前彻底消毒，拔除后立即放入预冷的含双抗的不完全培养基中，碘伏消毒约5 min，用含双抗的PBS(100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)反复冲洗，劈开牙冠，取出牙髓。用眼科弯剪将牙髓组织剪碎，移入离心管中，加入10倍量的组织消化液(3 g/LⅠ型胶原酶和 4 g/L Dispase)，轻轻振荡，使组织均匀地悬浮在消化液中，37 ℃消化1 h，并吹打为单细胞悬液，镜下观察细胞已呈圆形悬浮。将形成的单细胞悬液通过孔径为200目的细胞筛网过滤，于4 ℃，800 r/ min离心5 min去上清，沉淀用培养基充分混匀，添加培养液(含体积分数为15%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺的α-MEM培养液)，置于CO₂培养箱中培养；每隔3 d换1次培养液，14 d左右在显微镜下能观察到克隆的形成。当细胞生长至80%-90%汇合时，胰蛋白酶消化，离心沉淀细胞，每10⁶个细胞(50 mL培养瓶贴满侧壁)用冻存液(含10%二甲基亚砜的培养液)重新悬浮，加入冻存管，密封后混匀，立即放入液氮中约60 min，-80 ℃冰箱长期保存。用时取出冻存的细胞，在 37 ℃复苏，离心去掉冻存液，用培养液悬浮，接种于培养皿，待细胞长满后再消化进行高低密度连续传代培养。细胞贴壁后，用0.25%胰酶37 ℃消化40 min，4 ℃ 800 r/min离心5 min，弃上清，沉淀按1∶2比例传代。

牙髓干细胞向神经细胞方向诱导分化：①配制预诱导液：MEM、体积分数为20%胎牛血清、质量浓度为10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子。②配制神经诱导液：1 μmol/L氢化可的松、2%二甲基亚砜、200 μmol/L丁羟基茴醚、 10 μmol/L forskolin、0.1 mmol/L β-巯基乙醇。③取复苏的人牙髓干细胞，贴壁达80%-90%融合时弃原培养液，加入预诱导液培养24 h后换诱导液继续培养，每3 d更换诱导培养液。传代培养2次后制作细胞爬片，以未诱导细胞为对照。

RT-PCR检测：诱导细胞80%左右呈现出神经元样细胞形态时(8 d)收集细胞，以0.01 mol/L PBS洗2遍，加入TRIzol，每管1 mL，按说明书操作步骤提取细胞总RNA，以此为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，采用Primer 5.0软件设计胶质纤维酸性蛋白引物(预期产物382 bp，上游为5’- CTG TTG CCA GAG ATG GAG GTT-3’，下游为5’- TCA TCG CTC AGG AGG TCC TT- 3’)；巢蛋白引物(预期产物 471 bp，上游为5’-GGC AGC GTT GGA ACA GAG GTT GGA-3’，下游为 5’–CTC TAA ACT GGA GTG GTC AGG GCT-3’)；骨钙素引物(预期产物为315 bp，上游为5’-CAT GAG AGC CCT CAC ACT -3’，下游为5’-AGA GCG ACA CCC TAG AC-3’)；骨涎蛋白(预期产物 972 bp，上游为5’-ATG AAG ACT GCT TTA ATT TTG CTC AG-3’，下游为5’-TCA CTG ATG GTA GTA ATA ATT CTG ACC-3’)；人β-actin为内参(预期产物 285 bp，5’-AGC GAG CAT CCC CCA AA-3’，5’-GGG CAC GAA GGC TCA TC-3’)。

免疫荧光检测：取诱导后第14天细胞接种于玻片上， 24 h后取出，PBS冲洗，95%丙酮固定20 min，按照说明书滴加 anti-Stro-1、anti-Col-Ⅰ、牙本质涎蛋白(dentin sial op rotein，DSP) 一抗。4 ℃孵育过夜。采用人牙龈成纤维细胞作为阴性对照。间接荧光抗体为 Rhodamine标记的兔抗羊IgG、FITC标记的鼠抗兔 IgG、羊抗鼠IgM。阴性对照细胞(牙龈成纤维细胞)采用DAPI衬染细胞核(蓝色荧光)。

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讨论

研究表明在脊髓、血管、骨髓、上皮、视网膜、肝脏等多个胚层来源的组织中发现了成体干细胞，但迄今还不能证实所有组织都存在干细胞^[6-9]。Miura等^[5]报道从脱落乳牙的残留牙髓中分离出了多潜能的能够分化为成牙本质样结构的干细胞群。牙髓组织来源的干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。本实验采用氢化可的松、二甲基亚砜、丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇作为诱导剂，诱导培养的牙髓干细胞也分化为神经元样细胞和神经胶质细胞，并表达巢蛋白，胶质纤维酸性蛋白等神经细胞特异性标志。

关于成体干细胞可塑性的机制有多种学说，发育保留学说逐渐受到重视^[10-11]，该观点认为机体组织中都含有发育过程中曾经出现的干细胞谱，且干细胞数量与发育潜能原始性成反比，说明机体各种组织中存留下来的未分化的干细胞，参与组织的修复和重建，保持组织形态和功能的完整。从这个意义上说，可以认为牙髓干细胞也可能是牙齿发育过程中存留下来的干细胞。啮齿类动物发育中的牙齿有神经前体细胞特异性标志巢蛋白表达就是证据之一^[12]。最近还检测到在人发育中或成年恒牙的成牙本质细胞中有巢蛋白的表达，并且在牙本质细胞分化成熟后表达下降，而龋病或损伤等病理条件下表达增加^[13]。本实验对牙髓干细胞体外诱导后也出现神经特异性蛋白标志巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白，表明牙髓干细胞向神经方向的横向分化潜能可能与组织发生有关。

Woods等^[14]实验证实牙髓干细胞在治疗成人脑损伤方面有特殊疗效，牙髓干细胞也有神经元方向分化的潜能，具有分化为神经元和神经胶质细胞的潜能。Nosrat等^[8]研究发现牙髓干细胞能产生多种神经营养因子，与三叉神经元复合培养可刺激轴突的生长；还发现牙髓干细胞可以为多巴胺能的神经元提供营养支持，而且在体外可分化为神经元。牙髓干细胞来源广泛，与脑组织同样来源于外胚层，是否相同条件下牙髓干细胞比其他中胚层来源的骨髓干细胞更容易分化为神经元样细胞，又或者分化的比例更高？这依赖于更进一步的实验研究。考虑到新生儿缺氧缺血性脑病是缺氧后脑部神经元受损或缺失而引起，那么牙髓干细胞是有希望用于临床治疗新生儿缺血缺氧性脑病的干细胞之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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